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| 確定樣品中含有蘆薈苷成分TLC定性檢測 | |||
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本文分為上下2篇此篇文章為下篇文章您可以在頁尾點(diǎn)擊查看上段文章。 二、高效逆流色譜法的研究進(jìn)展：溶劑系統(tǒng)的選擇對于HSCCC分離十分關(guān)鍵。遺憾的是到目前為止溶劑系統(tǒng)的選擇還沒有充分的理論依據(jù)，而是根據(jù)實(shí)際積累的豐富經(jīng)驗(yàn)來選擇。根據(jù)溶劑系統(tǒng)的極性，可以分為弱極性、中等極性和強(qiáng)極性三類。經(jīng)典的溶劑系統(tǒng)有正己烷-甲醇-水、正己烷-乙酸乙醋-甲醇-水、氯仿-甲醇-水和正丁醇-甲醇-水等11。在實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，總結(jié)分析并參照相關(guān)的專著及文獻(xiàn)，從所需分離的物質(zhì)的類別出發(fā)去尋找相似的分離實(shí)例，選擇極性適合的溶劑系統(tǒng)，調(diào)節(jié)各種溶劑的相對比例，測定目標(biāo)組分的分配系數(shù)，最終選擇合適的溶劑系統(tǒng)12。
本次實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)產(chǎn)物是蘆薈苷，為中等級性化合物，這類化合物在乙酸乙酯和氯仿中有一定的溶解性,根據(jù)兩相溶劑系統(tǒng)選擇原則，可以選擇以乙酸乙酯或氯仿為有機(jī)相主體的溶劑系統(tǒng),適用溶劑體系為乙酸乙酯-甲醇-水或氯仿-甲醇-水。在乙酸乙酯-甲醇-水體系中,隨著甲醇比例的增大，蘆薈苷類化合物在水中的溶解性增強(qiáng),因而分配系數(shù)變小。在氯仿-甲醇-水體系中,隨著甲醇比例的增大,蘆薈苷類化合物在有機(jī)相中的溶解性增強(qiáng),由于氯仿的密度比水大,水在上相而氯仿在下相,因而分配系數(shù)也是變小。根據(jù)貴曉霞13等人在HSCCC分離天然產(chǎn)物中苷類化合物中的最新研究，在苷類化合物的分離中,主要用了三類溶劑體系,即正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水,醋酸乙酯(氯仿)-甲醇(乙醇)-水,醋酸乙酯-正丁醇-水。
正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水此類體系主要分離極性較小的單糖苷類,可根據(jù)化合物極性差別調(diào)整不同比例的甲醇、醋酸乙酯等來調(diào)節(jié)體系的極性,達(dá)到分離目的。常用的溶劑體系有:正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水(6∶3∶2∶5),正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(1∶1∶1∶1)
醋酸乙酯(氯仿)-甲醇-水此類體系主要分離單糖苷,雙糖苷類。由于氯仿毒性大,不利于環(huán)保,醋酸乙酯使用的越來越多。可根據(jù)需要在上下相中加入不同體積比的甲醇、乙醇、醋酸乙酯等來調(diào)節(jié)體系的極性,常用的體系有醋酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)。
醋酸乙酯-正丁醇-水該體系用于分離極性較大的雙糖苷類。一般通過調(diào)整正丁醇比例來分離不同極性物質(zhì)。若目標(biāo)組分易溶于該體系上相,加入乙醚可將組分拉向下相,反之,則加入三乙基乙胺鹽較合適。常用溶劑體系有醋酸乙酯-正丁醇-水(2∶1∶3)
陳存社14等采用幾種溶劑系統(tǒng)做對照,從南非進(jìn)口的開普蘆薈凝膠粉末中分離蘆薈有效成分,實(shí)驗(yàn)表明∶采用氯仿-甲醇-丙酮-水（9∶8∶1∶8）為溶劑系統(tǒng),分離出蘆薈大黃素苷、蘆薈大黃素,效果最佳。袁黎明等利用氯仿-甲醇-水（4∶3.8∶2）的溶劑分離系統(tǒng),亦能對蘆薈中的蒽醌類植物成分進(jìn)行有效的分離,分離后得到12個(gè)分離效果較好的色譜峰。而王春燕15等采用氯仿-甲醇-水（9∶10.5∶8）,從蘆薈生藥中一次性分離得到蘆薈甙(純度99.99%)和蘆薈大黃素(純度95.83%),分別達(dá)到定量和鑒別用化學(xué)對照品要求。但上一屆師姐祁潔珍參考陳存社、袁黎明、王春燕等人的文獻(xiàn)進(jìn)行驗(yàn)證的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)結(jié)果均得不到理想的分離效果，原因可能是：一、在配置過程中，發(fā)現(xiàn)體系很容易乳化，經(jīng)過靜置等方法也不能消除，造成在分離過程中基線不穩(wěn)，而且峰形不漂亮，還沒掌握消除乳化現(xiàn)象的方法；二、科研過程中有錯(cuò)，缺乏誠信。
祁潔珍師姐用薄層色譜法和高效液相色譜法測定了蘆薈有效成分樣品在分離用溶劑系統(tǒng)的K值,確定最佳分離體系為（１）：氯仿-甲醇-水（4：3.2：2）和（２）：乙酸乙酯-甲醇-水（5：1.2：5），應(yīng)用高速逆流色譜法將蘆薈樣品一次性分離得到蒽醌類有效成分,再用高效液相色譜法檢測分離成分的純度。用溶劑體系（１）進(jìn)行高速逆流色譜法分離得到兩組蒽酯類成分,第一組分含有一未知醌類化合物,第二組成分含有蘆薈苷和蘆薈大黃素成分,經(jīng)高效液相色譜法定量分析得,未知物的純度達(dá)90%，蘆薈苷和蘆薈大黃素的純度都沒有達(dá)到預(yù)期的效果，用溶劑體系（２）進(jìn)行高速逆流色譜分離，但是分離結(jié)果沒有達(dá)到預(yù)期效果。用（１）溶劑體系可使蘆薈中的蒽醌類化合物得到有效的分離，但是所分得的蘆薈苷和蘆薈大黃素的純度較低，在以后的實(shí)驗(yàn)中，可將分得的兩組成分再用另外的溶劑體系二次分離，可望得到高純度的蘆薈苷與蘆薈大黃素單體，分別達(dá)到定量和鑒別用化學(xué)對照品的要求。三、初步實(shí)驗(yàn)方案：本實(shí)驗(yàn)擬探究用HSCCC分離蘆薈苷單體的最佳溶劑系統(tǒng)，在用HSCCC之前將先用其他方法進(jìn)行分離，比較各種方法的分離效果及優(yōu)劣勢HSCCC方案簡略如下：
（一）、確定樣品中含有蘆薈苷成分TLC定性檢測：自行制備硅膠薄板常規(guī)點(diǎn)樣1~20μL（樣品與標(biāo)準(zhǔn)品平行），展開劑為乙酸乙酯：甲醇：水=25：4：3（體積比），若比移值太小，可適當(dāng)增加大極性溶劑的比例；若比移值太高，可適當(dāng)降低大極性溶劑的比例.按常規(guī)展開，取出薄層板，放平晾干后噴氫氧化鉀-甲醇溶液顯色（蒽醌苷在堿性條件下的顯色反應(yīng)），對比樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值，確定蘆薈苷存在與否。HPLC定量檢測：(外標(biāo)法)
精密稱（量）取對照品和供試品，分別制成對照品溶液和供試品溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），計(jì)算含量。色譜條件可參照色譜柱;流動相:30%-60%甲醇水溶液線性洗脫25min；柱溫：室溫，檢測波長：365nm（254）
（二）、摸索溶劑系統(tǒng)條件
1、先根據(jù)一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行試實(shí)驗(yàn)：1)參考貴曉霞的溶劑系統(tǒng)：醋酸乙酯-乙醇-水(5∶1∶5)、王春燕：氯仿-甲醇-水（9∶10.5∶8）、祈潔珍：氯仿-甲醇-水（4：3.2：2）進(jìn)行條件的探索，以考察分層情況，包括分層時(shí)間，上下兩相的體積比、有無乳化現(xiàn)象等，并用HPLC測定各系統(tǒng)的分配系數(shù)：樣品溶于一定體積的溶劑系統(tǒng)中，各取等
體積的上相、下相，風(fēng)干后溶于等體積的單一溶劑，測定上相的色譜峰面積A1，下相的色譜峰面積A2，Ka=A1/A2。一般K值在0.5～2之間樣品可以得到有效的分離。或用TLC法：樣品在等體積上下相中分配達(dá)到平衡后,TLC展開,通過斑點(diǎn)大小或顏色深淺來判斷各組分在兩相間的分布狀況。
2)選取上述各個(gè)溶劑體系，用高速逆流色譜儀分離蘆薈甲醇浸膏，色譜條件如下：以溶劑系統(tǒng)的上相為固定相、下相為流動相；以8ml/min的恒流速將上相泵入作為固定相，以2ml/min的恒流速將下相泵入，螺旋管轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速800r/min，紫外檢測波長254nm。記錄分離結(jié)果并分析3)HSCCC分離條件（溶劑系統(tǒng)）的優(yōu)化
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整溶劑體系的選擇：溶劑體系是HSCCC分離的關(guān)鍵。好的溶劑體系需滿足以下條件：(I)溶劑系統(tǒng)不會造成樣品的分解或變性。(ii)溶劑系統(tǒng)不會干擾樣品的檢測。(iii)各個(gè)組分在其兩相的分配系數(shù)在0.5~2之間，且有一定的差值，并且各組分的分配系數(shù)值要有足夠的差異，分離因子最好大于或等于1.5;(iv)溶劑系統(tǒng)的分相時(shí)間不超過30秒。上下兩相體積比合適，以免浪費(fèi)溶劑;(v)盡量采用沸點(diǎn)低的溶劑，以方便后續(xù)處理。(vi)盡量避免使用毒性大的溶劑。然后配制各種不同的兩相溶劑體系，看其分相時(shí)間是否在30s之內(nèi)，如果在30s之內(nèi)分相，加入適量的樣品，利用HPLC依次測定各組分在每個(gè)溶劑體系中上相和下相的濃度，并計(jì)算其分配系數(shù)。同時(shí)還要考慮是否能有效地分離蘆薈的有效成分，直到選出合適的體系。將上述選定的溶劑體系配制、分相、脫氣后應(yīng)用于HSCCC，并對其轉(zhuǎn)速、流速、分離溫度、固定相比例和洗脫梯度等條件進(jìn)行優(yōu)化，選出最優(yōu)的HSCCC分離條件。
①螺旋管轉(zhuǎn)速的選擇：螺旋管柱的旋轉(zhuǎn)速度對兩相的混合程度具有決定性的影響作用，同時(shí)它產(chǎn)生的離心力場對固定相的保留也具有決定性的影響。高界面張力的溶劑系統(tǒng)：使用較高的轉(zhuǎn)速，以使兩相之間有劇烈的混合而促進(jìn)分配和減少質(zhì)點(diǎn)傳遞的阻力。低界面張力的溶劑系統(tǒng)：使用較低的轉(zhuǎn)速，避免過分的混合作用引起樣品區(qū)帶沿螺旋管長度的展寬和乳化作用帶來的固定相流失。②流速的影響：流動相流速也會影響兩相的分布，一般情況下，流動相流速越大，固定相流失加重，但流速過慢會導(dǎo)致分離時(shí)間過長，從而造成對溶劑的浪費(fèi)。③溫度的影響：溫度的提高溶劑的砧度有很大的影響，一般提高溫度會獲得高的保留值，而相反降低溫度則得到低的保留值，但一般溫度不可能提高太多，因?yàn)樗玫亩际怯袡C(jī)溶劑，沸點(diǎn)很低。
還有一種方法粗制 將風(fēng)干后的蘆薈粉末，加氯仿回流充分提取2小時(shí)，振搖，趁熱過濾，除去苷元及其他游離蒽醌衍生物，殘?jiān)诒砻婷箫L(fēng)干，以除去剩余的氯仿。將殘?jiān)糜谒魇教崛∑髌渲校?5％乙醇水浴回流加熱提取4小時(shí)，趁熱過濾，濾紙用95％乙醇反復(fù)洗滌3次，棄去濾渣，向?yàn)V液中緩慢加入5％氫氧化鉀溶液，玻璃棒攪拌，同時(shí)以PH試紙調(diào)至9～10，靜置30分鐘后過濾，沉淀以95％乙醇洗滌3次，合并洗液，置真空干燥箱中，以0.8Mpa，60～70℃，減壓濃縮至干，此沉淀即為總蒽醌苷的鉀鹽。沉淀加入95％乙醇，使沉淀懸浮于乙醇中，緩慢加入冰醋酸，調(diào)至PH值中性，水浴加熱，趁熱抽濾，濾液濃縮，濃縮液加醋酸鉛液，均勻振搖，待沉淀不再繼續(xù)出現(xiàn)，過濾，沉淀以蒸餾水沖洗3次。將沉淀置水中，以HS脫鉛，過濾，濾液用1％氫氧化鈉調(diào)PH值至中性，以iso-proH重結(jié)晶，冰浴過濾，所得晶體為粗制蘆薈苷。
精制 將所得晶體溶解于70％甲醇中，溶液上Sephadex LH-20凝膠柱層析，以70％甲醇不斷沖洗，分段收集。所洗脫依次得到：蘆薈大黃素雙葡萄糖苷、大黃酚葡萄糖苷、蘆薈苷。后段收集淡黃色結(jié)晶，減壓濃縮至干，即得到精制蘆薈苷結(jié)晶。上一頁：植物中的蘆薈苷的提取活性成分的常用方法
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