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| 10種常用的微生物菌種保藏方法你知道幾種？ | |||
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臨床微生物實驗室經常能夠分離到一些有意義的菌種，但接種在平板上的細菌放4℃冰箱只能保存數天，并且細菌在培養基上移種3次后，其形態、菌落、毒力等均易發生變異，監測日常工作的室內質控用標準菌株也需要長期留存。所以盡可能長期有效地留存菌種對于系統地分析當前流行株的生物學、分子生物學特征及耐藥性變遷，醫院感染病原學調查、新藥臨床研究都十分重要的意義。
本文介紹幾種常用的菌種保存方法，如下：
一、常規保存法
該法操作簡單，只需普通冰箱保存，每個臨床微生物實驗室均可采用。但缺點是留存時間短，傳代頻繁，菌種易變異。
二、半固體穿刺保存法
用穿刺接種法將細菌培養物接種于半固體培養基內，經 37℃18-24h培養后，加一層無菌的液體石蠟，厚度約為 1cm，置冰箱保存。腸道桿菌及葡萄球菌等，一般可保存3-6個月。當需傳代移種時，將半固體菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊，再取菌移種于新的培養基。將沾有少量液體石蠟的接種環浸于 95％酒精中片刻，再燒灼滅菌以免直接在酒精燈上燒灼時，液體石蠟四處濺散而引起污染。如保存副溶血性弧菌可加入NaCl制成3.5%高鹽半固體，在室溫下可保存 1個月。
三、斜面保存法
⑴普通瓊脂斜面保存法：葡萄球菌、腸道桿菌等對營養要求不高的一股細菌可接種于普通瓊脂斜面上，斜面底部應加少許無糖肉膏液，以防干涸 (但變形桿菌"OX"及傷寒桿"O"菌株宜接種于干燥的瓊脂斜面以防變異)。用橡皮塞塞緊，經37℃18-24h培養后，存放于 4℃冰箱中，一般可保存3-6個月。
⑵血液瓊脂斜面保存法：鏈球菌及肺炎球菌等對營養要求較高的細菌應接種于血液瓊脂斜面上，37℃培養生長后，放4℃冰箱保存。鏈球菌須半個月至1個月移種一次，肺炎球菌則須 4d移種一次。
⑶雞蛋斜面保存法：將細菌接種于雞蛋斜面上，經 37℃18-24h培養后，加無菌液體石蠟至斜面浸液，再超出約1cm，置4℃冰箱保存。此法用于保存含有Vi抗原的沙門氏菌及其它含表面抗原的細菌，可保存3-6個月。
⑷呂氏血清斜面：白喉棒狀桿菌可保存在該培養基上，其成份為 1 %葡萄糖肉湯 (pH7.4) 1份，無菌牛血清或兔血清3份。白喉棒狀桿菌在此培養基上生長迅速、旺盛，菌體形態典型，如在培養基中再加入5%-10%的中性甘油，則培養出的白喉棒狀桿菌異染顆粒更為明顯，單24小時后即衰老成為多形態，很少有異染顆粒，菌體粗大3-4倍，置4℃可保存2周至1個月。
四、砂土管保存法
適用于產芽孢的細菌
將過篩后的中性細砂烘干，裝入小試管內約lcm高，塞以棉塞，滅菌烘干備用。用無菌生理鹽水洗下培養基上的細菌培養物，制成菌懸液。然后吸此菌懸液約0.5ml注入砂土管內，以砂土全部浸濕為度。塞好棉塞，放入干燥器內抽干。然后放在裝有氯化鈣(吸水劑)的干燥瓶內，置冰箱保存備用。需用時可取一接種環砂土接種于適宜培養基上培養即可。
五、低溫冷凍保存法
實驗室必須配備-20℃以下低溫冰箱，冰箱溫度越低，保存的時間越長。
六、濾紙片低溫冷凍保存菌種方法
將新華濾紙片剪成3mm×3mm，經高壓蒸汽滅菌置無菌器皿中備用，0.5ml無菌帶蓋塑料離心管。將待保存菌種在血平板上分離純化后，用無菌小鑷子夾住濾紙片，在平板上刮取多量細菌，放在塑料離心管內，1只離心管中可放數十片帶菌濾紙片，然后蓋上蓋子，用膠布將蓋口封嚴，注明患者姓名，菌名及保存日期等以備查找。將塑料管放在-70℃冰箱內保存。使用時將菌種分別從塑料離心管中取出1片，放入增菌肉湯中,35℃孵育18～24ｈ，再將菌懸液移種于血平板上。本方法適于保存對營養要求不高的細菌，而不適于苛養菌的保存。
七、濕牛奶冷凍法
材料 ①保護劑牛奶的準備：新鮮牛奶經脫脂棉反復 3次過濾后，10磅10min高壓蒸氣滅菌后，冰箱保存備用。②菌種管的處理：先經清潔液浸泡1天，之后用清水沖洗，再用蒸餾水浸泡過夜，以達中性，然后管口塞上棉花，經15磅30min高壓蒸氣滅菌備用。
方法 將各種細菌種于各自生長良好的平板培養基上，經分純后在37℃孵箱孵育18h后，用準備好的保護劑牛奶洗下菌苔，然后用無菌毛細滴管吸取菌懸液滴入菌種管球部，每管球部約有一半的菌液，之后火焰封口，保存于-20℃冰箱。抵抗強的細菌至少可保存3年，抵抗力弱的細菌保存不低2年。
八、細菌鑒定卡保存菌種
本法適用于使用VITEK全自動微生鑒定儀的實驗室。方法是將鑒定卡標注后直接放置-20℃冰箱保存，復蘇時將鑒定卡直接從-20℃移至35℃，待小孔液體完全融化后，以無菌手續，用注射器抽吸出陽性生長孔內的液體，點種于合適平板，置35℃孵箱內24～48小時即可。該法生化卡內的細菌反復凍融 5次，分離出的細菌效果相同。葡萄球菌屬、腸桿菌屬、念珠菌屬存活時間不小于29個月；腸球菌屬、黃桿菌屬、不動桿菌屬存活時間不小于21個月,鏈球菌屬和假單胞菌屬存活時間不小于10個月。
九、商品化菌種保存管
每只保藏管中含20-25個小珠以及緩沖液，使用時將菌落挑入緩沖液中，混勻，將緩沖液吸去，置-70℃冰箱保存可達10年，-20℃冰箱可保存1-3年。復蘇時，只需將小珠接入肉湯或平板上滾動即可。商品化菌種保存管操作簡單，但價格偏高。筆者預計隨著經濟的不斷發展和實驗室條件的改善，使用的單位將會越來越多。
十、冷凍真空干燥保存法
該法是目前保存菌種的最佳方法，具有如下幾個突出的優點：①適用范圍廣。除少數不產生孢子只產生菌絲體的絲狀真菌不宜采用此方法保藏外，其他各大類微生物如細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及病毒均可采用此方法保藏；②保藏期長，成活率高。有人報道保藏在真空冷凍干燥安培管中的真菌成活期長達40多年，一般微生物至少可保存10余年；③微生物在保藏期內可避免其它雜菌污染；④便于攜帶運輸，易實現商品化生產。其缺點為需要一定的設備（冷凍真空干燥機）、操作繁瑣等。菌種管由傳統的玻璃菌種管改為0.5ml帶蓋塑料離心管。方法：①將塑料離心管置耐高壓塑料離心管盒內并用雙層報紙包好，高壓蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。②在凈化工作臺內將脫脂牛奶洗下的濃厚菌懸液用長毛細玻璃滴管加到塑料離心管的底部，每只0.2ml左右，切記不要將牛奶污染離心管口。③將加好菌液的離心管盒置-20℃冰箱預凍，預凍好后把離心管盒放置到冷凍干燥機干燥箱內凍干。④凍干后在凈化工作臺內壓好離心管蓋，不抽真空。貼標簽，用封口膜封離心管口。放-20℃冰箱保存。
臨床微生物實驗室可以根據本室的條件，挑選最適合的菌種保存法，也可以加以改良，其原則是除了菌種存活外，還必須保證其生物學性狀不發生改變。
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